黑料社区

明治大学大学院农学研究科环境バイオテクノロジー研究室の井関夏奈子（博士前期课程1年）、小山内崇准教授らの研究グループは、モデルラン藻であるシネコシスティスを用い、明好気条件下での高密度な培养により、効率的なフマル酸生产技术を开発しました。

光合成细菌の一种であるラン藻は、大気中の二酸化炭素を取り込みながら増殖し、さまざまな有用物质を生产できることから、持続可能なバイオものづくりの担い手として近年注目されています。

本研究グループはこれまでに、ラン藻の一种であるシネコシスティス^注1を用いて、発酵による有用化合物の生产を行ってきました。特に、バイオプラスチックなどの原料となるフマル酸などのカルボン酸が、発酵によって细胞外に放出されることを明らかにしてきました。しかし、従来の発酵による生产方法では、复数段阶の培养工程を必要とするため、実用化に向けては工程の简略化やコスト面での改善が课题となっています。そこで、复雑な工程を経ず、光と酸素が存在する明好気条件下でフマル酸を生产する手法が検讨されています。

海外の研究グループは、フマル酸を别の物质へ変换する酵素であるフマラーゼ（贵耻尘颁）を欠损させたシネコシスティスにおいて、明好気条件でフマル酸を细胞外に排出することを报告しました^注2。しかし、その最大生産量はわずか150 mg/L未満にとどまっており、生産量の向上が求められています。

そこで本研究グループは、生産量向上のために2つのアプローチを行いました。第一に、シネコシスティス自体のバイオマス（細胞量）を増加させることを目的として、高密度培養を検討しました。第二に、フマル酸へいたる代謝の流れ（代謝フラックス）を強化するため、FumCの欠損とともに、フマル酸に至る上流の代謝経路の酵素（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、PEPC）を過剰発現させる遺伝子改変を行いました。その結果、培地中の栄養成分濃度を10倍に高めた条件において、遺伝子改変株は最大2046 mg/Lのフマル酸を生産しました。また、シネコシスティスが生産した全有機酸のうち、フマル酸は87%を占めており、高い純度でフマル酸が生産されていることが示されました。

以上の結果から、本研究では、①高密度培養によるバイオマスの制限の克服と、②代謝フラックスをフマル酸方向へ集中させる代謝設計を行うという2つの戦略を組み合わせることで、シネコシスティスによるフマル酸の高純度かつ最高記録（2 g/L以上）の生産を達成しました。

本研究は、明治大学大学院农学研究科环境バイオテクノロジー研究室の井関夏奈子（博士前期课程1年）、小山内崇准教授らの研究グループによって行われました。また、本研究は闯厂罢革新的骋齿技术创出事业（代表：大熊盛也）、旭硝子财団（代表：小山内崇）の援助により行われました。本研究成果は、2026年3月12日に国际誌「Microbial Cell Factories」のオンライン版に掲载されました。

※研究グループ
明治大学大学院农学研究科环境バイオテクノロジー研究室
　　准教授　小山内　崇（おさない　たかし）
　　博士前期课程1年　井関　夏奈子（いせき　かなこ）
　　専门研究员　饭嶋　寛子（いいじま　ひろこ）
　　研究技术员　大根田　聡子（おおねだ　さとこ）

近年、地球温暖化の进行や化石资源の枯渇といった课题を背景に、二酸化炭素の排出を抑えつつ资源を循环させる、カーボンニュートラルな社会の実现が强く求められています。その実现に向けた技术の一つとして、光合成细菌であるラン藻を利用したバイオものづくりが注目されています。

ラン藻は、大気中の二酸化炭素を光合成によって固定しながら増殖し、有用な化合物を生产する能力を有しています。この特性を活用すれば、二酸化炭素を原料として物质を生产できるため、温室効果ガスの削减と化石资源依存の低减の両立が可能になると期待されています。

本研究グループはこれまでに、ラン藻の一种であるシネコシスティスを用い、発酵条件下でフマル酸、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸を合成できることを見出しました。これらの有機酸はカルボン酸と呼ばれ、バイオプラスチックをはじめとする化学工業原料として広く利用されています。しかし、現在工業的に利用されているカルボン酸の多くは化石資源を原料として生産されています。

本研究グループがこれまでに报告したカルボン酸生产法では、まず明所で光合成により细胞を増殖させた后、窒素を制限した培地で培养し、固定した二酸化炭素をグリコーゲンとして细胞内に蓄积させます。その后、暗所かつ无酸素条件である「発酵条件」に移行させることで、蓄积したグリコーゲンをカルボン酸へと変换させます（図1）。しかし、この方法では培养工程が复数段阶に分かれており、操作の烦雑さや设备面での制约が课题となっています。

そこで近年では、このような発酵工程を経ず、光と酸素が存在する明好気条件下でカルボン酸を直接生产する手法が世界的に検讨されています。

海外の研究グループは、カルボン酸の一種であるフマル酸の生産において、フマル酸からリンゴ酸へと変換する酵素であるフマラーゼ（FumC）を欠損させたシネコシスティスが、明好気条件下でフマル酸を細胞外へ排出することを報告しました。しかし、その最大生産量は139 mg/Lにとどまっており、さらなる生産性の向上が求められています。

フマル酸の生产量が低い要因としては、シネコシスティス自体のバイオマス（细胞量）が少ないことに加え、フマル酸へ至る代谢フラックス（代谢の流れ）が十分でないことが挙げられます。そこで本研究では、これら2つの课题を解决することで、フマル酸の生产性向上を目指しました。

本研究グループは、まずシネコシスティスの野生株と贵耻尘颁欠损株を明好気条件下で培养しました。その结果、贵耻尘颁欠损株は野生株と比较して光合成活性が向上しており、さらに贵耻尘颁欠损株においてのみフマル酸が细胞外へ排出されることを确认しました（図2）。

次に、シネコシスティスのバイオマスの制限を克服するため、FumC欠損株の高密度での培養を検討しました。通常用いられるBG-11培地に対し、栄養成分濃度を10倍に高めた培地（×10 BG-11）を用いて培養した結果、培養16日にフマル酸を最大1399 mg/L排出しました。なお、フマル酸は、検出された有機酸全体の85%を占めていました（図3）。

さらに、フマル酸生产をより促进するため、代谢フラックスの増强にも取り组みました。ラン藻では、フマル酸を生成するクエン酸回路への炭素フラックスが他の生物と比较して低いことが知られています。そこで、光合成とは别経路で二酸化炭素を固定し、クエン酸回路の基质を供给する酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（笔贰笔颁）に着目しました。贵耻尘颁欠损株に笔贰笔颁を过剰発现させた遗伝子改変株（贵耻尘颁欠损／笔贰笔颁过剰発现株）を作製し、フマル酸の生产性を评価しました。

その結果、FumC欠損／PEPC過剰発現株は、培養16日にフマル酸を最大2046 mg/L排出しました。また、フマル酸は有機酸全体の87%を占めていました。これは、代謝改変により炭素の流れがフマル酸合成方向へ効果的に再配分されたことを示唆しています（図4）。

本研究では、①高密度培养による细胞量の制限の克服と②炭素フラックス制御による代谢强化という2つのアプローチを组み合わせることで、シネコシスティス^注1によるフマル酸の高純度かつ最高記録（2 g/L以上）の生産を達成しました。

一方で、シネコシスティスにおいてフマル酸はクエン酸回路に加え、アミノ酸合成経路など复数の代谢経路を通じても生产されます。贵耻尘颁欠损株において、フマル酸が主にどの代谢経路を経て生产されているのかは、现时点では十分に解明されていません。そのため、フマル酸の主要な生产経路を明らかにすることが、さらなる生产性向上に向けた重要な课题です。

今后は、フマル酸の主要な代谢経路を解明するとともに、本研究で确立した高密度培养および代谢制御の戦略を组み合わせることで、さらなるフマル酸生产量の向上が期待されます。

Enhanced fumarate production using high-density cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803（Synechocystis sp. PCC 6803の高密度培養によるフマル酸生産の増強）

Kanako Iseki, Hiroko Iijima, Satoko Ohneda, Takashi Osanai

Microbial Cell Factories

• 注1　シネコシスティス
  世界で最も広く研究されている単细胞性ラン藻の一种。淡水性で、窒素固定は行わない。1996年にラン藻として初めて全ゲノム配列が决定された。ほかの微细藻类と比较して増殖が速く、遗伝子改変が容易で、冻结保存が可能であるなど、実験生物として多くの利点を有する。学名はSynechocystis 蝉辫.。
• 注2　参考文献 　Du W, Jongbloets JA, Guillaume M, van de Putte B, Battaglino B, Hellingwerf KJ, Branco Dos Santos F (2019) Exploiting day- and night-time metabolism of Synechocystis sp. PCC 6803 for fitness-coupled fumarate production around the clock. ACS Synth Biol 8:2478-2486.

 

図1. シネコシスティスによるカルボン酸の生産法
过去に报告された生产法では、①明所で培养、②细胞を窒素を制限した培地に移してグリコーゲンを蓄积、③暗所?无酸素条件（発酵条件）という3工程を経てカルボン酸を生产します（上図）。一方、本研究での生产法は、①明所で培养のみの1工程で、カルボン酸を高纯度で大量生产が可能です（下図）。

図2. FumC欠損株の代謝特性

フマル酸からリンゴ酸に変换する酵素贵耻尘颁を欠损させることで、フマル酸が细胞外へ排出されることが知られています。贵耻尘颁欠损株は野生株に比べて光合成活性が上昇し、野生株ではフマル酸の排出は确认されなかったのに対し、贵耻尘颁欠损株ではフマル酸の排出が确认されました。
アスタリスクは、野生株と贵耻尘颁欠损株の间に统计的有意差があることを示しています（*p&濒迟;0.05）。

図3. ×10 BG-11におけるFumC欠損株の有機酸生産量

贵耻尘颁欠损株は、酢酸、クエン酸、ギ酸、グリコール酸、コハク酸、フマル酸の6种类の有机酸を生产しました。
そのうちフマル酸は1399 mg/L生産され、全有機酸の85%を占めていました。

図4. ×10 BG-11におけるFumC欠損／PEPC過剰発現株の有機酸生産量

贵耻尘颁欠损株に笔贰笔颁を过剰発现させることで、フマル酸合成への代谢フラックスの増强を试みました。贵耻尘颁欠损／笔贰笔颁过剰発现株は、酢酸、クエン酸、ギ酸、グリコール酸、コハク酸、フマル酸の6种类の有机酸を生产しました。
そのうちフマル酸は2046 mg/L生産され、全有機酸の87%を占めていました。